免疫印跡法(WB)、免疫組化(IHC)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA),是免疫學(xué)常用工具,主要應(yīng)用于蛋白的定位、定性和定量。
其中 WB實(shí)驗(yàn)是先通過進(jìn)行跑電泳后,然后將分離好的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上,再利用抗原-抗體-標(biāo)記物顯色來檢測(cè)樣品,常用于定性和半定量。
圖| WB實(shí)驗(yàn)流程圖
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WB實(shí)驗(yàn)常見十問
1、細(xì)胞水平做WB,一般多少數(shù)量細(xì)胞提的蛋白夠做WB?做組織樣品的WB的時(shí)候,怎樣處理樣品?
答:一般5×10^6就足夠了;特殊情況需根據(jù)自己的研究來確定。
必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理(注意降溫),蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好,離心要充分(12000轉(zhuǎn)/min,10-15min)。膜蛋白必須用更劇烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng),需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。
2、蛋白變性后可以存放多久?
答:-80℃,若沒有反復(fù)取出凍融,保存一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。
3、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的WB檢測(cè)嗎?
答:當(dāng)然可以,有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品;有時(shí)如果抗體特異性高且效價(jià)高,同時(shí)使用2種一抗,可在一張膜上檢測(cè)2種不同蛋白。
4、上樣超載多少會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響?可以用什么方法來增加上樣量?
答:正常超載30%不會(huì)有問題的,但不建議超載加樣。
可以濃縮樣品,或者根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白,還可以考慮加大膠的厚度,以增大上樣孔體積,比如嘗試1.5mm厚的膠。
5、我所測(cè)定的蛋白分子量是100KD左右,按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%,但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方,不知為何?
答:上述提到的兩種凝膠均可以使用,因?yàn)?05KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi),但需注意不同濃度目的條帶位置肯定會(huì)發(fā)生一定地偏移。具體參照如下圖(李記有3款預(yù)混膠、預(yù)制膠,詳情請(qǐng)參考“關(guān)于蛋白電泳那些事")
6、一般一次上樣的蛋白總量是多少,跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎?
答:WB一般上樣30-100μg不等,結(jié)果跟目的蛋白的表達(dá)豐度、上樣量、一二抗的量以及孵育時(shí)間都有關(guān)系,也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。
最開始摸條件時(shí),各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)(背景也容易就出來了)。要拿到好的結(jié)果,如果抗體好的話比較容易,抗體不好的話就需要反復(fù)測(cè)試。
7、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎?
答:一般來說提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了,操作時(shí)保持冰浴,保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明必須使用特殊方法,一般來說沒有區(qū)別。
8、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶,為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜表現(xiàn)不是很好?
答:這是正常的,大分子的蛋白轉(zhuǎn)移很慢,你延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流,大分子一端就會(huì)好的多,但是小分子的就有可能會(huì)變淡(轉(zhuǎn)過的表現(xiàn))。注意一點(diǎn):麗春紅染色較好,不是你的目標(biāo)蛋白成功轉(zhuǎn)移至膜上的標(biāo)準(zhǔn),只能作為一個(gè)粗略參考。
9、做半定量WB,內(nèi)參β-actin,GAPDH哪個(gè)好?
答:一般選用β-actin就可以,也可以使用GAPDH,但是如果做能量、代謝這方面的研究還是盡量選擇β-actin。
10、請(qǐng)問一下PVDF膜和NC膜的區(qū)別是什么?為什么PVDF膜用甲醇浸泡的目的?
答:PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合,有疏水作用但相對(duì)較弱,和蛋白接合較牢,不易脫落,結(jié)果較好。PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán),使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合,做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。
硝酸纖維素膜(NC膜)是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián),反復(fù)洗幾次后,蛋白容易掉下來,結(jié)果較差。
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活動(dòng)時(shí)間:2021.8.10-2021.8.13
活動(dòng)編號(hào):Li210810H
活動(dòng)范圍:全國(guó)生物相關(guān)終端客戶